Caracterización de las fibras del músculo gluteus medius en equinos por métodos histoquímicos e inmunohistoquímicos (página 2)

MATERIAL Y MÉTODOS

En el estudio se emplearon 16 equinos seleccionados para
participar en prueba de competencia
completa, 8 fina sangre de carrera
y 8 mestizos fina sangre Sellp francés (50% y 50%) con una
edad promedio de 6 años, pertenecientes a la Escuela de
Equitación de la Escuela de Caballería Blindada de
Quillota. Los animales, durante
los últimos tres meses, previo a la obtención de la
muestra, no
habían realizado entrenamiento
para competencia de prueba completa y se mantenían en
pesebreras y en un patio de ejercicio.

Biopsias musculares. De cada caballo se obtuvo 1
biopsia muscular a 4 cm de profundidad. Las biopsias fueron
tomadas con una aguja percutánea de 6 mm de
diámetro interno (Henckel, 1983), de acuerdo al procedimiento
descrito anteriomente por Islas y col. (1997).

Una vez obtenidas las muestras fueron colocadas sobre
placas de poliestireno, bañadas en OCT para
congelación de tejidos (Tissue
Tek, Miles Sci., USA) y luego sumergidas durante 30 segundos en
Isopentano (2-metilbutano Lab. Merck) enfriado previamente en
nitrógeno líquido (Dubowitz, 1985 ). Las biopsias
fueron almacenadas en un termo de nitrógeno a una temperatura de
-196°C hasta su posterior procesamiento. Para dismi-nuir la
alteración que sufre el tamaño fibrilar debido a la
contracción que experimentan las muestras obtenidas con
aguja de biopsia, se dejaron transcurrir 2 a 3 minutos desde la
obtención hasta su congelación (López-Rivero
y col., 1993).

Métodos histoquímicos. De cada muestra se
obtuvieron cortes seriados en un criostato (Microm HM 500) a
-20°C, de 10 mm de grosor que fueron incubados para demostrar
la actividad mATPasa (E:C:3.6.1.3.) a pH 4,38. La
capacidad oxidativa de las fibras se evaluó en cortes
seriados teñidos mediante NADH-TR (E.C. 1.6.99.3)
(Dubowitz, 1985).

Según los patrones de tinción de mATPasa
las fibras fueron clasificadas como tipo I (contracción
lenta) o tipo IIA y tipo IIB (contracción rápida)
(Brooke y Kaiser, 1970). Las fibras tipo IIB de acuerdo a la
intensidad de la tinción con NADH-TR se clasificaron en
oxidativas y no oxidativas.

Composición fibrilar. Se determinó
la proporción de cada tipo de fibra muscular del tejido
obtenido de la biopsia. Un área representativa de cada
biopsia conteniendo al menos 200 fibras fue examinada
sistemáticamente en las microfotografías en blanco
y negro (x100) de los cortes teñidos con
mATPasa.

Para obtener los porcentajes se examinó un
área representativa de cada biopsia y se determinaron las
frecuencias relativas de las fibras tipos I, IIA y IIB. Los tipos
IIB oxidativas y IIB no oxidativas fueron calculadas sobre las
microfotografías en blanco y negro (X100) en los cortes
teñidos con NADH-TR mediante el cómputo de 200
fibras /biopsia.

Inmunohistoquímica. Cortes de 10 mm fueron
colocados en portaobjetos con L-lisina y rehidratados con PBS por
10 minutos. Posteriormente, se lavaron con PBS por 10 minutos y
se dejaron con solución de bloqueo (suero normal de cabra
al 10% en PBS (Vector S1000) durante 30 minutos en una
cámara húmeda a temperatura ambiente (20 –
25ºC). Se sacaron los cubreobjetos y se les aplicó la
solución de bloqueo y luego los anticuerpos monoclonales
que reaccionan con las isoformas de la MHC Slow, SIGMA M8421),
Fast, (SIGMA M8276), 35 y H2 durante 2 horas en diluciones 1:200,
1:500, 1:2000 y 1:200; respectivamente. Se lavaron los
portaobjetos con PBS durante 10 minutos 3 veces y se
aplicó el segundo anticuerpo (Anti-inmunoglobulina G de
ratón biotinilada en cabras) en dilución de PBS
1/200 por 60 minutos a temperatura ambiente. Se lavó con
PBS durante 5 minutos 3 veces y se aplicó el complejo ABC
(DAKO) por 1 hora a temperatura ambiente en cámara oscura.
Se lavó con PBS durante 5 minutos 2 veces, se
agregó la solución de diaminobencidina por 2 a 3
minutos (DAB, SIGMA D5637) y se reveló con peróxido
de hidrógeno (MERCK 24/1865/410).
Posterior-mente, se lavaron las muestras con PBS por 5 minutos,
se deshidrataron con etanol al 100% por 5 minutos dos veces y con
xilol al 100% por 5 minutos. Las preparaciones selladas con
entellán se guardaron en lugar oscuro hasta la
obtención de las fotografías, determinándose
el porcentaje de fibras positivas y negativas para cada
anticuerpo en 200 fibras por biopsia en fotografía
a color.

Análisis estadístico. Los
resultados se expresaron en porcentaje y se aplicaron pruebas
estadísticas convencio-nales para obtener
la media y desviación estándar de cada variable.
Las diferencias entre las medias fueron valoradas por medio de
una prueba "t" de Student, correlación y la prueba de
concordancia estimada por la diferencia de las medias y la
desviación estandar de las diferencias (Bland y Altman
1986).

RESULTADOS

Todas las secciones transversales de las fibras
teñidas con la técnica mATPasa, mostraron
apariencia normal distribuídas en forma de mosaico, no
observándose alteraciones patológicas. Basado en la
reacción mATPasa posterior a la incubación a pH
ácido (4,38) las fibras musculares se clasificaron en 3
categorías: I (Negras), IIA (Blancas), IIB (Intermedias)
(las fibras IIB son clasifi-cadas actualmente como IIX). Los
subgrupos de las fibras IIX fueron determinados con la
tinción NADH-TR (fig 3 E) en fibras oxidativas y no
oxidativas. No se determinó la presencia de fibras tipo
IIC, las cuales tienen una moderada reacción con la
mATPasa, situación que fue corroborada con la
inmunohistoquímica, ya que estas fibras son
análogas a las clasificadas como híbridas I + IIA.
En el estudio se realizó un recuento promedio de 200
fibras para cada una de las biopsias para ambos métodos
histoquímicos, siendo los porcentajes y desviaciones
estándar obtenidos para la fibra tipo I 14 %± 3,2,
IIA 39% ± 3,7 IIX oxidativa 30% ± 5,3 y 17%
± 5,5 IIX para las fibras no oxidativas. ( fig.1 ). Con la
técnica inmunohistoquímica se observaron tres
poblaciones de fibras que contienen MHC, fibras lentas tipo I (1)
y fibras rápidas IIA (2) y IIX (3) y una población de fibras que contienen IIA + IIX
(4) fig. 3A-D), no determinándose fibras I +
IIX.

Figura 1. Composición histoquímica e
inmunohistoquímica de las fibras musculares de acuerdo
con el contenido de las cadenas pesadas de miosina (mhc)
expresados como porcentaje (promedio y desviación
estándar).
Histochemical and immunohistochemical composition of muscle
fibre types according thes chain mhc content showed as average
and standard deviation.

La reactividad de las fibras a los anticuerpos
monoclonales utilizados contra la cadena pesada de miosina y sus
isoformas se presenta en la figura 1, revelando el estudio
inmunohistoquímico un promedio y desviación
estándar de 16% ± 3,7 para las fibras tipo I, un
35% ± 6,8 tipo IIA, un 29% ± 8,1 tipo IIX y un 20%
± 5,8 IIA + IIX ( fig. 1). El análisis de correlación
determinó que existe correlación entre ambas
técnicas solamente para las fibras tipo I
(p<0,05). Sin embargo, la prueba de t y la prueba de
concordancia determinaron al comparar ambas técnicas que
no existen diferencias significativas en los porcentajes de las
fibras tipo I, IIA IIX y IIA +IIX (p >0, 05),
obteniéndose entre ambas técnicas una concordancia
de 94% (15/16), 100 (16/16), 94% (15/16 ) y 94%(15/16)
respectivamente. En la figura 2 se presentan los gráficos de las diferencias para las
técnicas histoquímicas e
inmuno-histoquímicas entre las fibras tipo I (A) , tipo
IIA (B) , tipo IIX (C), y tipo IIA+IIXA (D).  

Figura 2. Valores de
concordancia entre las tecnicas histoquimica e
inmunohistiquimica para las fibras tipo i
0000000(a),tipo iia
(b), tipo iix (c) y tipo iia+iix (d). presentados como
porcentajes de fibras y diferencias de
0000000medias.
0000000Agreement
values between histochemical and immunohistochemical thecnics
for fiber type i (a), type iia (b), type
0000000x (c) and type iia+iix
(.d). present as percentage of fibres and mean
diference).

DISCUSIÓN

La mayoría de los músculos
esqueléticos están compuestos por fibras con
diferentes propiedades contráctiles y metabólicas y
el uso de técnicas histoquímicas apropiadas ha
permitido la caracterización de los distintos tipos de
fibras. La tipificación de las fibras musculares se ha
basado durante muchos años en la técnica mATPasa;
sin embargo, este procedimiento tradicional, como lo han probado
las técnicas electro-foréticas e
inmunohistoquímicas, tiene algunas limitaciones

por el hecho que un número considerable de fibras
tiene una composición de la miosina mixta y esta
técnica no permite determinarlas en forma precisa (Staron,
1991; Andersen y col., 1994).

La inmunohistoquímica utilizando anticuerpos
mono-clonales permite una identificación más
acertada de las diferentes isoformas de la MHC presentes en el
músculo esquelético y sus resultados serían
más confiables que los obtenidos por la
histoquímica tradicional (Linnane y col., 1999). Por otra
parte, si bien el método
inmunohisto-químico es cualitativo, es altamente sensible,
por lo que fibras con pequeñas o grandes cantidades de MHC
pueden ser identificadas con esta técnica (Pette y Staron,
1997).

En este estudio se analizó un total de 3.200
fibras por las técnicas histoquímicas e
inmuno-histoquímicas, determinándose los
porcentajes de los diferentes tipos de fibras. Los resultados
obtenidos muestran que no existen diferencias significativas en
la determinación de las fibras tipo I, tipo IIA, IIX y
IIA+IIX entre ambas técnicas, resultados similares a los
obtenidos por Shina y col. (1992) y Serrano y col. (1996) en
trabajos realizados en esta especie. Las fibras clasificadas como
tipo I y IIA por la técnica histoquímica
estarían formadas por miosina lenta y rápida,
Respectiva mente, y son identificadas con los anticuerpos
monoclonales respectivos utilizando la técnica
inmuno-histoquímica. Trabajos realizados en atletas
humanos han demostrado la coexistencia de isoformas de MCH I y
IIA en algunas fibras (Klittgaard y col.,1990) que con la
técnica histoquímica se determinan como tipo AB,
reafirmándose la utilidad de la
determinación de la inmunohistoquímica cuando se
trata de identificar fibras híbridas

La reactividad de las fibras a los anticuerpos
monoclonales utilizados contra la cadena pesada de miosina y sus
isoformas se presenta en el Cuadro 1 y fig.3. En este estudio,
del total de fibras analizadas se demostró que no existen
diferencias significativas en la clasificación de los
diferentes tipos entre ambas técnicas.

Figura 3. Cortes seriados de las biopsias del
músculo Gluteus medius tomadas a 4 cm de
profundidad.
A-D inmunohistoquímica anticuerpos low, fast 35 y H2; E
Tinción con NADH-TR.
Las fibras marcadas 1, 2, 3 y 4 tienen anticuerpos MHC-1,
MHC-2A; MHC 2X; MHC 2A+2X, respectivamente, cuando son
identificadas por la inmunohistoquímica y se
corresponden con las fibras tipo I, tipoIIA, tipo IIX ox;
tipoIIX no ox.
Serial sections of Gluteus medius muscle biopsies at 4cm of
depth.
A-D immunohistochemical antibodies low fast 35 and H2; E
NADH-TR staining
The fibres labelled 1, 2, 3 and 4 have MHC-I, MHC-IIA; MHC-IIX;
MHCIIA + IIX antibodies, respectively, and correspond with
fibres type I, type IIA, type IIX oxidative and IIX non
oxidative.

Cuadro 1. Especificidad de
anticuerpos monoclonales para determinar isoformas de la cadena
pesada de
0000000000miosina mhc en fibras musculares
de equino .
0000000000Specificity of monoclonal
antibodies to determine isoforme of the myosin heavy chain mhc in
muscular
0000000000fibres of horses.

La técnica NADH-TR permite clasificar las fibras
en oxidativas y no oxidativas según la intensidad de la
tinción en forma subjetiva, lo que induce a una
determinación poco precisa de las fibras, a diferencia de
la inmuno-histoquímica, en la cual la
identificación de las fibras IIX y IIA + IIX se basa en la
cuantificación de fibras inmunoteñidas o no, frente
a los anticuerpos monoclonales. Usando estos anticuerpos se puede
determinar en forma objetiva las fibras tipo IIX y las IIA+IIX
(denominadas fibras tipo IIB oxidativas y no oxidativas
respectivamente según la reacción a las NADH- TR
(Linnane y col.,1999). Así se logra una
clasificación más exacta de ellas, esto se debe a
que existen fibras que presentan fenotipos mixtos de la MHC, lo
que se demuestra en una alta diversificación de los
porcentajes de los subtipos de las fibras rápidas en las
regiones más superficiales del músculo Gluteus
medius en caballos jóvenes (López-Rivero y col.,
1996 ), situación que no se observa en estos animales
debido a que son adultos.

Este estudio confirma que existe una buena concordancia
superior al 95% entre los métodos histoquímicos e
inmunohistoquímicos de las fibras I, IIA, IIX y IIA+IIX,
sin embargo, solo se obtuvo correlación entre ambas
técnicas en la determinación de las fibras tipo I,
situación que se presenta en algunas oportunidades y es
por ello que la realización de la prueba de concordancia
sería más adecuada para comparación de
parámetros que la correlación en algunas
situaciones (Bland y Altman, 1986). Las diferencias observadas en
los resultados se deberían a la presencia, en una misma
fibra, de dos isoformas de MHC (Staron y Pette, 1986; Staron,
199. Por otra parte, trabajos realizados por Siek y col. (1995) y
Botinelli y col., (1994) han demostrado que las fibras con
cantidad homogénea de MHC tienen un gradiente respecto a
su reactividad con la mATPasa. Por lo tanto, las isoformas de MHC
y el contenido de ellas en la fibra pueden influir en la
reacción histoquímica de la mATPasa y su posible
limitación en la diferenciación objetiva de las
fibras musculares por esta técnica.

La técnica inmunohistoquímica permite una
clasificación más exacta de la población
fibrilar del músculo Gluteus medius del equino, ya
que se puede realizar la cuantificación de las fibras IIX
y IIA +IIX que con la técnica mATPasa son clasificadas
como IIX. Además, si en el futuro se cuenta con nuevos
anticuerpos monoclonales se podría llegar a diferenciar
isoformas de MHC del equino como ya se ha logrado en otros
especies.

Los resultados obtenidos permiten concluir, que, si
bien, existe concordancia entre ambas técnicas en los
animales estudiados, la inmunohistiquimica permite una
cuantificación más exacta de las fibras musculares,
corrigiendo errores que se producen al utilizar la técnica
histoquímica en la clasificación de fibras
híbridas y tipo IIB. La determinación de una
correcta composición fibrilar del músculos es
importante cuando se desea seleccionar equinos para prepararlos
para un deporte en
particular.

Financiado por Proyecto FONDECYT
1990-382.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen la colaboración brindada
por la Escuela de Equitación del Regimiento de
Caballería Blindada de Quillota

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Vet., V. MERINO/1, BQ, MS; H. ROJAS/1, MV, C. CARRILLO/1; M.
ROJAS E/1.; A. ZEGPIG/2
1 Facultad de Medicina
Veterinaria,
Universidad de
Concepción, Casilla 537, Chillán.
2 Escuela de Equitación del Ejército de
Chile, Quillota
3 Facultad de Veterinaria,
Universidad de Córdoba, España.